分光光度法

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。它具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，是生物化学实验中最常用的实验方法。许多物质的测定都采用分光光度法。在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与不同波长相对应的吸收强度。

简介

上述的紫外光区与可见光区是常用的。但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。波长范围：

1、200～400nm的紫外光区

2、400～760nm的可见光区

3、2.5～25μm(按波数计为4000cm-1～400cm-1)的红外光区。

基本原理

许多物质的溶液具有颜色，有色溶液所呈现的颜色是由于溶液中的物质对光的选择性吸收所致。不同的物质由于其分子结构不同，对不同波长光的吸收能力也不同，因此具有其特有的吸收光谱。即使是相同的物质由于其含量不同，对光的吸收程度也不同。利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或利用物质对一定波长光的吸收程度来测定物质含量的方法，称为分光光度法。

朗伯一比尔（Lambert - Beer）定律是分光光度法的基本原理。当一束单色光通过一均匀的溶液时，一部分被吸收，一部分透过，设入射光的强度为I0，透射光强度为I，则I/I0为透光度，用T表示。

当溶液的液层厚度不变时，溶液的浓度越大，对光的吸收程度越大，则透光度越小。

即：-lgT=a*c（式中a为吸光系数，c为浓度）

当溶液浓度不变时，溶液的液层厚度越大，对光的吸收程度越大，则透光度越小。

即：- lgT=a*b（b为液层厚度）

将以上两式合并可用下式表示：lgT=a*b*c

研究表明：溶液对光的吸收程度即吸光度（A）又称消光度（E）或光密度（OD）与透光度（T）呈负对数关系，即：A=-lgT

故A=a*b*c。

检测仪器

紫外分光光度计，可见分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。

基本原理

当一束强度为I0的单色光垂直照射某物质的溶液后，由于一部分光被体系吸收，因此透射光的强度降至I，

则溶液的透光率T为：T=（I0-I）/I0

根据朗伯（Lamber-Beer）定律：

A=a*b*c

式中A为吸光度，b为溶液层厚度（cm），c为溶液的浓度（g/dm3)， a为吸光系数。其中吸光系数与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。溶液中其他组分（如溶剂等）对光的吸收可用空白液扣除。

由上式可知，当溶液层厚度b和吸光系数a固定时，吸光度A与溶液的浓度成线性关系。在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光谱），从中确定最大吸收波长 ，然后以此波长 的光为光源，测定一系列已知浓度c溶液的吸光度A，作出A~c工作曲线。在分析未知溶液时，根据测量的吸光度A，查工作曲线即可确定出相应的浓度。

应用

利用分光光度法对物质进行定量测定主要有以下几种方法：

1、标准管法

将待测溶液与已知浓度的标准溶液在相同条件下分别测定A值，然后按下式求得待测溶液中物质的含量。

CT=（AT/AS）*CS

2、标准曲线法

先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测定出它们的A值，以A值为横坐标，浓度为纵坐标，作标准曲线。在测定待测溶液时，操作条件应与制作标准曲线时相同，以待测液的A值从标准曲线上查出该样品的相应浓度。

3、吸收系数法

当某物质溶液的浓度为1mol/L，厚度为1cm时，溶液对某波长的吸光度称为该物质的摩尔吸光系数，以ε表示。ε值可通过实验测得，也可由手册中查出。

已知某物质ε值，只要测出其A值再根据下式便可求得样品的浓度：c=A/ε。